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染色步驟

來源:本站  點擊次數:次  發布時間:2021-8-6

病理制片技術——常規染色

2020-9-07 12:5358

蘇木精(hematoxylin)和伊(eosin)染色方法,簡稱HE染色方法,是生物學、細胞學與組織學最廣泛應用的染色方法。在病理科稱為常規染色 方法。病理學的診斷都是以HE方法為基礎的。染色的目的是把組織切片或細胞涂片等浸入染料及其他染色劑配成的染色液中,經過適當的時間和處理,使組織或細 胞及其他成分染上不同深淺的顏色,產生不同的折射率,從而便于光學顯微鏡下進行觀察和研究。

進行染色前進行染色液的配制,應根據工作量的多少配制相應量的染液,同時應注意溶液種類的選擇、溶液濃度、pH值等,另外也應注意配方的合理選擇。在實際工作中,應做到以下幾點。

  • (1)保持染液的清潔,應經常過濾或更換。
    (2)染色時間應根據組織的種類、染液的新舊及特殊要求而決定。
    (3)染色環境溫度對染色效果也有著密切的影響,故染色時間必須依據不同條件靈活掌握。
    (4)脫蠟干凈與否對染色效果有著重要影響,烤片溫度、脫蠟二甲苯的溫度、二甲苯的新舊和二甲苯脫蠟的時間長短都與染色有著密切關聯。
    (5)標本脫水的好壞及固定的充足與否對染色效果影響極大。
    (6)切片染色后,經梯度乙醇脫水,若每步的時間不足易造成切片發霧、模糊不清,影響診斷。

在染色過程中,既要按常規方法步驟進行操作,也應根據實際情況、個人經驗靈活運用,不斷總結,才能熟練掌握并提高實際工作能力與效率。

一、人工染色

人工染色已使用近百年,至今還在使用,既古老又實用。人工染色的設置因地區的差異設置也不同,但大多數的地方基本一樣。

1.石蠟切片HE人工染色程序(見表8.1)。

1 75℃恒溫烤箱烤片20 min
2 二甲苯I 2~5 min
3 二甲苯Ⅱ 2~5 min
4 二甲苯Ⅲ 2~5 min
5 無水乙醇I 1min
6 無水乙醇Ⅱ 1min
7 95%乙醇I 1min
8 95%乙醇Ⅱ 1min
9 85%乙醇 1min
10 80%乙醇 1min
11 70%乙醇 1min
12 自來水水洗3次,將水控凈
13 蘇木精? 5min
14 自來水水洗3次
15 l%鹽酸乙醇分化 3~5s
16 自來水水洗3次
17 O.5%氨水返藍
18 自來水水洗3次
19 1%伊紅水溶液 1min
20 自來水水洗3次
21 70%乙醇 1min
22 80%乙醇 1min
23 95%乙醇I 1min
24 95%乙醇Ⅱ 1min
25 無水乙醇I 1min
26 無水乙醇Ⅱ 1min
27 無水乙醇Ⅲ 1min
28 二甲苯I 1min
29 二甲苯Ⅱ 1min
30 二甲苯Ⅲ 擱置至封片

2.注意事項

(1)石蠟切片放入恒溫箱中烤片,溫度不可過低或過高,以75℃為宜,否則在染色過程中容易發生脫片。
(2)組織切片脫蠟要經二甲苯三次才能徹底。切片從恒溫箱取出后應趁熱浸入二甲苯以利于徹底脫蠟。使用一段時間后,第一缸二甲苯融的蠟較多應倒棄,其后的二甲苯依次前移,最后一缸換新鮮的二甲苯。
(3)切片經70%乙醇后入蘇木精染液前,必須自來水水洗3次,最后1次最好用蒸餾水水洗并控干。這樣可以保證Harris蘇木精染色能力持久,而不會因為低濃度乙醇的混合而過早的喪失染色能力。
(4)Harris蘇木精染液配制的好壞直接影響切片染色質量。好的蘇木精染液500 ml正常染色能力為2500張左右。為保證染色質量應及時更換染液。
(5)蘇木精染液要經常過濾以保證染色清潔而不在切片上有染色渣的出現。
(6)鹽酸乙醇分化液配制參見本書第十二章。分化時間可根據分化液的新舊適當調整,新的分化液時間短些。分化的目的就是讓該染上要清晰地染上,而不該著色的一定要分化掉。
(7)氨水返藍液濃度不可過高,返藍時間不可過高,不要過長,否則會發生脫片現象。
(8)1%伊紅水溶液是理想的胞漿染液。要選擇好水溶性的伊紅染料使胞質鮮艷一些,切片不但漂亮且利于觀片。
(9)切片染色后的脫水要充分,每道乙醇脫水的時間不要過短,尤其是三道無水乙醇更為如此。無水乙醇要勤更換。
(10)切片經最后一次無水乙醇后盡快地放人二甲苯中。在夏季室內濕度較大的環境中更是如此。如切片在濕度大的空氣中停留時間過長就會在封片時產生霧氣, 而不能現片。其原因是無水乙醇吸收了空氣中的水汽,在二甲苯中難以分離析出,當用中性樹膠封片后,二甲苯揮發,而水汽留在膠中產生霧氣。
(11)封片所使蓋玻片需大小合適、清潔。樹膠用量視蓋玻片大小而定,要求不發生溢膠或缺如。
(12)不提倡切片經無水乙醇,然后干燥,直接用中性樹膠封固。這樣會產生人為的細小黑點,與細胞核相似。
(13)封片要在通風廚中進行,防止二甲苯污染工作間,危害技師的身體。

二、自動染色機

自動染色機是近幾年才引進的病理自動儀器,在病理制片過程中發揮著重要的作用,它可以連續進行染色,自動記憶,染色效果好,質量控制到位。起到了手工無法比擬的作用。

1.液體設置:由于機器為電腦控制,染液順序及液體的設置根據染色機所設置的染色缸多少來調配。染色機基本模擬手工方法,利用機器手來完成操作程序見表8.2。

二甲苯 二甲苯 二甲苯 無水乙醇 無水乙醇 95%乙醇 85%乙醇 烤箱65℃













停機報警取籃處 二甲苯 二甲苯 二甲苯 無水乙醇 無水乙醇 95%乙醇 85%乙醇 伊紅 1% 氨水 1% 鹽酸乙醇 蘇木精 裝機

2.注意事項

  • (1)工作前先檢查染液及試劑,并開啟電源。
    (2)開啟進水開關。
    (3)調試好所需的染色程序,根據蘇木精一伊紅的新舊來調整時間。
    (4)將切片染色籃放人染色機后按提示鍵即可按程序進行染色。
    (5)聽到提示音響后,取出已染好的切片染色籃進行封片。
    (6)工作完成后,關閉電源,關掉水源,并蓋好染色缸。
    (7)染色機配制的無水乙醇及95%乙醇的程序比手工程序少,但不影響染色效果,因機械手在提升時有抖動作用,帶的液體很少。
    (8)定期取出活性碳過濾網晾曬保證使用。
    (9)工作結束后一定要取出鹽酸乙醇,以免長期放在機器內,腐蝕機器。

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